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Construcción en laboratorios y océanos de sistemas avanzados de fluorescencia para medir la biomasa, la fisiología y la fotosíntesis del fitoplancton

1. Propósito y contenido de la investigación

Propósito de la investigación

El objetivo del proyecto es la construcción de un pequeño instrumento de escritorio llamado sistema de inducción I por fluorescencia F y R Chipre (mini - fire) para el análisis de muestras discretas y la medición continua de la abundancia y estado fisiológico del fitoplancton en el océano. A diferencia de los fluorescentes frrf y Fire de generación anterior inventados y desarrollados por el equipo de rutgers, el nuevo instrumento mostrará una mayor sensibilidad (aproximadamente 10 veces) y proporcionará más parámetros fisiológicos en tiempo real. Nuevo instrumentoaltoLa sensibilidad hace que sean de gran valor para el trabajo de campo en alta mar.

contenido de la investigación

Evaluación de la actividad fotosintética del fitoplancton y otros organismos fotosintéticos mediante técnicas de fluorescencia variable- la evaluación rápida y no destructiva del estado fisiológico de los organismos fotosintéticos depende del uso de la óptica fluorescente de tasa de repetición rápida (frrf) y su tecnología para la posterior tecnología de inducción y relajación por fluorescencia (fire). Esta tecnología fue inventada y desarrollada por el equipo de rutgers. El método básico para evaluar la viabilidad biológica de la fotosíntesis se basa en la medición y análisis del perfil de 'fluorescencia variable' de la clorofila, característica del mecanismo fotosintético * (falkowski y otros lo revisaron en 2005). La tecnología de 'fluorescencia variable' se basa en la relación entre la fluorescencia de clorofila y la eficiencia del proceso fotosintético y proporciona un conjunto completo de parámetros de fluorescencia y fotosíntesis para organismos. Las mediciones ópticas son sensibles, rápidas, no destructivas y se pueden realizar en tiempo real e in situ.

Este método y los principios instrumentales implementados se establecen en la literatura de revisión por pares (falkowski y kolber 1995; kolber at al., 1998; Gorbunov y otros, 2000, 2001; Gorbunov y Falkowski 2004). Desarrollado originalmente para estudiar el fitoplancton en la columna de agua, la tecnología frr proporcionaPrecisiónInformación sobre el funcionamiento de las comunidades de fitoplancton y los efectos de los factores ambientales que controlan la productividad primaria marina (e.g., Falkowski y kolber 1995; Falkowski y Raven 2007; behrenfeld et al., 1996; coele et al., 2004; Falkowski et al., 2004). El uso de los fluorescentes frr y Fire de escritorio y buceo se ha convertido en una parte inseparable de la mayoría de los proyectos oceanográficos biológicos en los Estados Unidos y en el mundo.

Se han desarrollado técnicas de inducción I por fluorescencia F y preexcitación R (fire)Para medir un conjunto completo de características fotosintéticas y fisiológicas de los organismos fotosintéticos (gorbunov y Falkowski 2005). La tecnología Fire se basa en el registro y análisis de los transiciones fluorescentes causadas por una serie de destellos estimulados, cuya intensidad, duración e intervalo se controlan con precisión (figura 1 y Gorbunov y Falkowski 2005). La tecnología proporciona un conjunto completo de parámetros caracterizados por el proceso de iluminación fotosintética, la fotoquímica en el sistema óptico II (psii) y la transmisión de electrones fotosintéticos a la fijación de carbono. Debido a que estos procesos son particularmente sensibles a factores ambientales, la tecnología Fire proporciona la base para identificar y diagnosticar factores naturales (limitaciones nutricionales, irritación fotoquímica y fotoquímica, estrés térmico, etc.) y humanos de estrés, como la contaminación.

Figura 1Ejemplo de instantáneas de fluorescencia de. fire. La dinámica de la producción de fluorescencia se registra como resolución de tiempo de microsegundos, que consta de cuatro etapas: ()unoFase, 100 ms) pulso corto fuerte (conocido como flash de rotación única, stf) de 100 ms es adecuado para acumular psii saturado y medir la inducción de fluorescencia de Fo a FM (stf): (fase 2, 500 ms) luz de modulación débil se utiliza para registrar la energía cinética de relajación de la producción de fluorescencia a escala de tiempo de 500 ms: (fase 3, 50 ms) pulso largo fuerte (conocido como flash de rotación múltiple, mtf) de duración de 50 ms se utiliza para biblioteca de psii saturada y pq: (fase 4, 1 s) luz de modulación débil se utiliza para registrar la dinámica de reoxidación de la Biblioteca de pq a escala de tiempo de 1s. El análisis de la fase 1 ofrece: suma mínima agrandeProducción de fluorescencia (fo, fm); La eficiencia cuántica de la separación de carga fotoquímica psii FV / FM (stf); Sección transversal funcional del psii, σPSII; Y el factor de conexión (p). La fase 2 proporciona una constante de tiempo para la transmisión electrónica del receptor psii (es decir, reoxidación lateral del receptor qa). La fase 3 ofrece FM (mtf) y FV / FM (mtf). La fase 4 revela la constante de tiempo de transmisión electrónica entre psii y PSI (reoxidación de la Biblioteca pq).

Antecedentes biofísicos de la tecnología de fluorescencia variable- a temperatura ambiente, la fluorescencia de clorofila se produce principalmente en el psii. Cuando el Centro de reacción psii está abierto (oxidación de qa), la producción de fluorescencia es mínima, fo. cuando el Centro de reacción se reduce por Qa (por ejemplo, al estar expuesto a una luz fuerte), el Centro de reacción se cierra y la producción de fluorescencia aumenta a su alto nivel de fm. para detectar FO y fm, la tecnología Fire registra la Inducción de fluorescencia causada por una luz fuertemente saturada y pulsada (~ 100 μs, llamada flash de rotación única, stf) (figura 1 fase 1). La tasa de inducción de fluorescencia es proporcional a la sección transversal de absorción funcional del psii, mientras que la amplitud relativa del aumento de la fluorescencia FV / FM se define por la eficiencia cuántica de la fotoquímica del psii. La forma de la inducción fluorescente está controlada por la transferencia de excitación entre unidades fotosintéticas individuales y está definida por el 'factor de conexión' (kolber et al. 1998). Por lo tanto, sin transferencia de energía (p = 0), la inducción de fluorescencia es exponencial y se convierte en una curva inversa cuando P aumenta a un valor mayor de ~ - 0,5 a 0,7.

La energía cinética de la transmisión electrónica en el lado del receptor psii (es decir, la reoxidación de qa) se evalúa mediante el análisis de predinálisis de fluorescencia posterior a STF (fase 2 de la figura 1). La dinámica de fluorescencia consta de varias partes, ya que la velocidad de reoxidación de Qa depende del Estado del segundo receptor de electrones, qb, que funciona como receptor de doble electrones en movimiento:

Qa- Qb → Qa Qb- (150 - 200 ms) (1)

Qa- Qb- → Qa Qb= (600 - 800 ms) (2)

Qa- _ → Qa- Qb → Qa Qb- (~ 2000 ms) (3)

La respuesta (3) corresponde a las condiciones en las que QB se separó inicialmente del sitio de unión a la proteína d1. Además, un pequeño número de centros de reacción inactivados con transmisión electrónica dañada puede ayudar a los componentes más lentos de la precinámica. El software Fire utiliza tres componentes para analizar y procesar la prededinámica para recuperar la constante de tiempo de la transmisión electrónica (es decir, la oxidación q tqa).

La constante de tiempo de la transmisión electrónica entre el psii y el psi, tpsii - psi, fue recuperada del análisis de predinálisis de fluorescencia posterior al destello de rotación múltiple (mtf, fases 3 y 4 en la figura 1). En la mayoría de las condiciones fisiológicas, esta constante de tiempo está determinada por la velocidad de reoxidación de la Biblioteca de Quinona plasmática (pq) y es un orden de magnitud más lento que tqa.

Los parámetros de fluorescencia fire, que miden una serie de intensidades ambientales, pueden reconstruir la velocidad de transmisión electrónica fotosintética. Pf， Como función de la intensidad de la luz (curva de fotosíntesis e intensidad de la luz) (kolber y falkowski, 1993). PF es proporcional a la producción cuántica fotoquímica medida bajo los productos de luz y la luz ambiente (df '/ fm'). El análisis de estas curvas de fotosíntesis e intensidad proporciona una tasa de transferencia de electrones grandes (pmax) y un coeficiente de saturación de luz (ek). La fotosíntesis y la medición de la radiación se realizan utilizando una fuente de luz fotoquímica (al) de fire, que es controlada por computadora a través del software de adquisición de datos fire.

Antecedentes y conocimientos profesionales en I + DLos miembros del equipo de – Rutgers han acumulado más de 20 años de experiencia en el desarrollo de tecnologías y métodos de fluorescencia variable. Inventaron y desarrollaron más de 10 * instrumentos para la investigación biofísica (véase la lista de referencia del apéndice de las publicaciones de revisión por pares relevantes).

2. introducción del instrumento

Mini - Fire se basa en los mismos principios biofísicos que los instrumentos Fire de escritorio anteriores (gorbunov y Falkowski 2005), pero el nuevo instrumento es tres veces más compacto y diez veces más sensible. El límite inferior de la concentración de clorofila es tan bajo como a 0005 mg / m3, lo que hace que mini - Fire sea muy valioso para el muestreo in situ en alta mar.

Aquí, el equipo de Rutgers propone construir un mini - Fire (figura 2) que se utilizará para el análisis de muestras discretas (por ejemplo, muestras recogidas de botellas de oro Niza en el sitio) y / o para el muestreo continuo en el océano. El Instrumento estará equipado con una cámara de muestras que fluya para trazar continuamente la biomasa y las características fotosintéticas del fitoplancton. La siguiente es una lista de parámetros fisiológicos registrados por mini - Fire y las especificaciones técnicas del instrumento mini - Fire (figura 2). El instrumento se utilizará para el análisis de muestras discretas (por ejemplo, muestras recogidas de botellas de Niza en el sitio) y / o para el muestreo continuo en el océano. El Instrumento estará equipado con una cámara de muestras que fluya para trazar continuamente la biomasa y las características fotosintéticas del fitoplancton. La siguiente es una lista de parámetros fisiológicos y especificaciones técnicas del instrumento registradas por mini - fire.

Figura 2 fluorescente mini - fire, con sensibilidad mejorada.

Parámetros de medición:

● Producción mínima y hasta gran fluorescencia después de la adaptación oscura (fo, fm)

● Producción efectiva, mínima y hasta gran fluorescencia bajo adaptación a la luz (f ', fo', FM ') *

● fotoquímica a gran producción cuántica efectiva en sistemas ópticos II y psii (fv / FM y DF '/ f m))

● sección transversal de absorción psii funcional a tres longitudes de onda (pspsii)

● eficiencia de transferencia de energía entre unidades fotosintéticas ('factor de conexión')

● constante de tiempo de transmisión electrónica del lado del receptor psii (qa a qb, QA a QB -)

● constante de tiempo de transmisión electrónica fotosintética entre psii y PSI

● tasa de transferencia electrónica, ETR， Como función de la intensidad de la luz

● coeficiente de enfriamiento fotoquímico (qp) y coeficiente de enfriamiento no fotoquímico (npq) *

● a la tasa fotosintética grande, la pendiente inicial y el tiempo de rotación de la fotosíntesis (obtenido de las curvas F y e)

● estos parámetros se miden utilizando una fuente de luz fotoquímica (ela) y se registran como una curva de intensidad.

Especificaciones técnicas del sistema mini - fire:

● sensibilidad: 0005 - 100 mg / m3 de clorofila a (la concentración de muestreo se puede aumentar añadiendo un filtro de descompresión de densidad neutra)

● fuente de luz de excitación: azul (longitud de onda pico 450 nm, ancho de banda de 30 nm), verde (longitud de onda pico 530 nm, ancho de banda de 40 nm), naranja (longitud de onda pico 590 nm, ancho de banda de 30 nm), para estimular selectivamente fitoplancton en diferentes grupos funcionales.

● detección de emisiones: 680 nm (clorofila a) y 880 nm (clorofila a bacteriana), y otras longitudes de onda se pueden seleccionar utilizando filtros de emisión reemplazables.

● tamaño: 10 x 5 x 12 pulgadas